J9九游会生物细胞爬片免疫荧光实验步骤

来源:温梅维日期:2025-03-06

以下是实验室细胞染色操作步骤:

J9九游会生物细胞爬片免疫荧光实验步骤

步骤一：细胞洗涤

在培养板中，将已附着的细胞玻片用PBS缓冲液浸洗三次，每次持续三分钟，以去除细胞外的多余物质。

使用4%的多聚甲醛固定爬片15分钟，再次用PBS洗涤三次，每次三分钟，以确保细胞结构的完整性。

使用5%的Triton X-100（PBS配制）在室温下透化20分钟。若细胞膜上有表达的抗原可跳过此步骤。

再次用PBS洗涤玻片三次，每次三分钟，吸去多余液体后，在玻片上滴加正常山羊血清（前提是二抗来源是山羊），并于室温下封闭30分钟。

用吸水纸吸掉封闭液，不再洗涤，每张玻片中滴加适量稀释后的一抗，置于湿盒中，于4°C下孵育过夜。

用PBST浸洗爬片三次，每次三分钟，吸去多余液体后，滴加稀释好的荧光二抗，在湿盒中于20-37°C孵育1小时，再次用PBST浸洗切片三次，每次三分钟。注意：从此步骤开始，所有后续操作应尽量在昏暗环境中进行。

吸水纸吸干液体后，在玻片上滴加正常山羊血清，室温下封闭30分钟，确保后续实验的特异性。

用吸水纸吸掉血清封闭液，滴加稀释好的第二种一抗，之后也要在4°C的湿盒中避光孵育过夜。请确保第二种一抗和第一种一抗来源于不同物种（例如小鼠和兔）。

用PBST浸洗爬片三次，每次三分钟，随后滴加稀释好的第二种荧光二抗，在湿盒中于20-37°C孵育1小时，结束后再次用PBST洗涤切片三次，每次三分钟。注意：若第一种抗体使用红色荧光，则第二种必须选择不同颜色的荧光。

滴加DAPI荧光染料，避光孵育5分钟，然后用PBST洗涤四次，每次五分钟，以去除多余的DAPI。

用吸水纸吸干爬片上的液体，使用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下进行观察并采集图像。

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